組培室的污染來(lái)源一般可分為以下幾方面：接種前污染、接種時(shí)污染、接種后污染、母本帶菌。

一、接種前污染：培養(yǎng)基消毒不徹底

1、現(xiàn)象

培養(yǎng)基消毒不徹底，污染一般呈碟狀出現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)部，但也有在培養(yǎng)基表面或者瓶壁、瓶蓋表面出現(xiàn)的。

2、原因

原因可能是由于滅菌鍋加熱不均勻，培養(yǎng)基量太多，瓶子沒(méi)洗干凈等。

3、應(yīng)對(duì)

取若干批次培養(yǎng)基放置1～2周，觀(guān)察污染出現(xiàn)情況，即可對(duì)滅菌成功率做出合適的評(píng)價(jià)。將培養(yǎng)基放置1周左右再用，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控滅菌成功率的同時(shí)具備較大的使用緩沖時(shí)間，以應(yīng)對(duì)滅菌鍋失效等突發(fā)情況。

二、接種時(shí)污染：?jiǎn)T工操作或者相關(guān)除菌設(shè)備失效

1、現(xiàn)象

接種時(shí)帶來(lái)污染，污染物一般貼著培養(yǎng)物生長(zhǎng)，但少數(shù)情況下污染物也可能隨機(jī)散布在培養(yǎng)基表面。

2、原因

這方面的原因包括員工操作不符合無(wú)菌操作要求，超凈工作臺(tái)高效過(guò)濾器失效，超凈工作臺(tái)風(fēng)速過(guò)低，超凈工作臺(tái)表面沒(méi)做好消毒，接種器具消毒不徹底。組培工廠(chǎng)一般員工的污染率通常在3%左右，而由技術(shù)員進(jìn)行嚴(yán)格的接種操作時(shí)，污染率可控制到1%以下。如果一個(gè)組培工廠(chǎng)接種人員之間的污染率差異巨大，就應(yīng)該在“接種時(shí)污染”這個(gè)方面去著手，尋求解決辦法。

3、應(yīng)對(duì)

應(yīng)對(duì)的措施一般有定期檢測(cè)機(jī)臺(tái)過(guò)濾效果，檢測(cè)機(jī)臺(tái)氣流大小，規(guī)范員工操作，檢測(cè)高溫消毒器，檢測(cè)鐵盤(pán)或者紙片的消毒效果。

三、接種后污染：培養(yǎng)過(guò)程中，由氣流或小動(dòng)物帶來(lái)污染

1、現(xiàn)象

污染物一般散布在培養(yǎng)基表面，而不是貼著培養(yǎng)物生長(zhǎng)。有時(shí)由小動(dòng)物如螨蟲(chóng)或者薊馬帶入時(shí)，還能在瓶?jī)?nèi)看到微小的爬動(dòng)的蟲(chóng)子，這時(shí)的菌類(lèi)污染物可能從瓶蓋或者瓶壁向下生長(zhǎng)，也可能在培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出彎彎曲曲的軌跡（沿著蟲(chóng)子爬行的足跡生長(zhǎng)），螨蟲(chóng)污染的情況下，能觀(guān)察到瓶壁有蛛網(wǎng)狀細(xì)絲。

2、原因

原因可能是培養(yǎng)間潔凈度較差，氣流較快，使灰塵飄動(dòng)較多；緩沖不良使薊馬飛入；培養(yǎng)間人員衣著不規(guī)范帶來(lái)較多螨蟲(chóng)；或者沒(méi)有對(duì)污染進(jìn)行定期的監(jiān)控，使蟲(chóng)子帶來(lái)的污染有擴(kuò)散的機(jī)會(huì)。

3、應(yīng)對(duì)

首先應(yīng)該分清污染源。如果發(fā)現(xiàn)污染有在瓶間擴(kuò)散的跡象，最可能是蟲(chóng)子帶來(lái)的污染。應(yīng)即刻擰緊污染瓶蓋并清除污染瓶。平時(shí)應(yīng)注意培養(yǎng)間的緩沖區(qū)效果，規(guī)范員工衣著，定期清潔培養(yǎng)間，如每周拖兩次地。培養(yǎng)間內(nèi)可設(shè)置每晚臭氧消毒。最有效的措施還是定期檢查并清除污染。

4、關(guān)于螨蟲(chóng)污染

這里再補(bǔ)充一下個(gè)人看法。在一般潔凈程度的培養(yǎng)環(huán)境下，螨蟲(chóng)會(huì)隨機(jī)出現(xiàn)。畢竟人體就帶有螨蟲(chóng)。

觀(guān)察到螨蟲(chóng)污染時(shí)，有更多未觀(guān)察到的母瓶已經(jīng)被污染。因?yàn)轵x(chóng)從瓶口爬到培養(yǎng)基上，在真菌菌落長(zhǎng)出前這個(gè)階段不能被觀(guān)察到。當(dāng)1筐材料有較多污染時(shí)應(yīng)立即整筐丟棄。

有螨蟲(chóng)在瓶口螺旋內(nèi)未能進(jìn)入瓶?jī)?nèi)，這樣的母瓶在轉(zhuǎn)瓶前一直是潔凈的，在轉(zhuǎn)瓶后會(huì)爆發(fā)污染。

可能有少量不帶霉菌孢子的螨蟲(chóng)進(jìn)入瓶?jī)?nèi)，因而不能被觀(guān)察到。這樣的母瓶會(huì)被忽視并成為隱藏的傳染源。當(dāng)螨蟲(chóng)在瓶?jī)?nèi)大量繁殖，在瓶口進(jìn)進(jìn)出出，最終會(huì)出現(xiàn)真菌污染。

為控制螨蟲(chóng)污染，篩查是最主要措施，打藥效果并不明確。篩查操作應(yīng)該每3～7天一次，堅(jiān)持到整個(gè)培養(yǎng)間的螨蟲(chóng)污染率降到0.1%以下。然后每周全面清理霉菌污染，直到未發(fā)現(xiàn)疑似螨蟲(chóng)污染。

遇到螨蟲(chóng)爆發(fā)，往往是平時(shí)管理不善。這時(shí)看到明顯污染的只是一部分，更多的瓶子已經(jīng)有螨蟲(chóng)但未能被輕易觀(guān)察到。因此發(fā)現(xiàn)螨蟲(chóng)爆發(fā)后即使立即清理污染瓶，后續(xù)還是會(huì)出現(xiàn)污染持續(xù)增多的現(xiàn)象。配合著堅(jiān)持篩查，污染量出現(xiàn)高峰后會(huì)逐漸下降，而整個(gè)“螨蟲(chóng)病程”估計(jì)將持續(xù)2～3個(gè)培養(yǎng)周期。應(yīng)對(duì)措施良好的情況下，3個(gè)周期后應(yīng)該能將螨蟲(chóng)量控制到正常的水平，但此后也應(yīng)該有持續(xù)的監(jiān)控措施。

四、母本帶菌：組培物本身有內(nèi)生菌，或外植體消毒時(shí)保留了輕微帶菌的材料

1、現(xiàn)象

這類(lèi)污染必然緊貼著培養(yǎng)物表面開(kāi)始出現(xiàn)的。這類(lèi)污染既然能被保留下來(lái)，進(jìn)行帶菌組培，一般生長(zhǎng)較緩慢，在培養(yǎng)基內(nèi)呈較難觀(guān)察到絲狀。但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加，污染物的生長(zhǎng)速度也可能變快，污染變明顯（原因可能是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間細(xì)菌出現(xiàn)了快速生長(zhǎng)的變異，然后占據(jù)了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)）。

2、原因

一般植物體內(nèi)都或多或少地有內(nèi)生菌。輕微的污染不易被察覺(jué)，也不太影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，易被保留。

3、應(yīng)對(duì)

對(duì)于有內(nèi)生菌問(wèn)題，那就嘗試使用沒(méi)有內(nèi)生菌的材料，包括莖尖脫毒處理等。同一批母本得到的培養(yǎng)物，也可能有少部分不含內(nèi)生菌的材料，仔細(xì)挑選著部分材料進(jìn)行擴(kuò)繁，其余的也可利用幾代。如果內(nèi)生菌一直不影響組培物生長(zhǎng)，也可以無(wú)視。

對(duì)于輕微污染的情況，應(yīng)該在一開(kāi)始就盡可能仔細(xì)地挑選出無(wú)菌材料進(jìn)行重點(diǎn)擴(kuò)繁。當(dāng)然，合適的接種操作也可以將輕微污染一直控制在可控的范圍，如每次轉(zhuǎn)瓶時(shí)都切除所有老組織，只用新的組織進(jìn)行擴(kuò)繁或出苗。